1.引言

心血管疾病（CVD）是老年人发病率高的慢性疾病，主要包括冠心病、脑血管病、高血压、心力衰竭和风湿性心脏病。CVD是过早死亡和生活质量降低的主要原因，也是全球死亡的首要原因。作为最常用的心血管药物，阿替洛尔（ATE）、美托洛尔（MET）、阿托伐他汀（ATO）和苯扎贝特（BZB）在地表水、河流的悬浮固体和沉积物中检测到了这些药物，表明它们在地表水环境中的浓度可能更高。此类污染物可能导致生物体的异常生理功能。因此，有必要探讨心血管药物对可能接触这些药物的水生生物的发育和表观遗传状态的影响。

在本研究中，斑马鱼被选为模型水生生物，以研究四种心血管药物（ATE、MET、ATO和BZB）对斑马鱼早期发育的毒性。

2.实验方法

根据斑马鱼早期的发育特点，选择了合适的观察时间点。在受精后24-96小时期间每24小时观察一次斑马鱼胚胎/幼鱼。在受精后28小时，从每个实验区随机选择三个胚胎，通过显微镜记录视频（1分钟），进行自发运动分析，每个胚胎拍摄2-3个视频。通过计算自发线圈收缩的频率来确定运动频率（受精后28小时）。在受精后48小时，从每个实验区随机选择三个胚胎，记录15–20秒的视频（每个胚胎2–3个视频），以测量心率。在受精后96小时，从每个实验区随机选择三只幼鱼来捕捉图像，以测量身体长度和眼睛大小，使用诺达思的斑马鱼微视行为分析系统对这些视频和图像进行分析。此外，孵化率在受精后48-60小时期间每2小时记录一次，表示为孵化胚胎/暴露的胚胎总数。最后，从每个实验区中随机选择2-3条斑马鱼（受精后120小时），利用诺达思斑马鱼行为轨迹跟踪系统分析明暗循环下的自由泳活动。

3.实验结果

3.1.四种心血管药物对斑马鱼胚胎的发育毒性

3.1.1.自发运动和孵化

如图1（A）所示，ATE、MET、ATO和BZB均抑制了斑鱼胚胎的自发运动，在0.5–500μg·L-1的暴露浓度下，抑制率分别为3%–32%、2%–38%、14%–49%和15%–48%。ATO和BZB的作用强于ATE和MET。

如图1（B）所示，BZB、ATO、ATE和MET以剂量依赖性的方式抑制了受精后54小时斑马鱼胚胎的孵化，在0.5–500μg·L-1的暴露浓度下，抑制率分别为10%–65%、17%–61%、4%–47%和4%–28%。

图1

3.1.2斑马鱼胚胎的发育参数

如图2所示，暴露于药物的斑马鱼胚胎的死亡率与对照组之间没有显著差异（<10%）。在这四种药物中，BZB对斑马鱼幼鱼的生长表现出最强的影响，而ATO对心率的影响最大。体长的减少表明，这些药物导致斑马鱼幼鱼发育迟缓。暴露于ATE、MET和BZB对斑马鱼的眼睛大小没有影响，而ATO导致眼睛肿胀5%-15%（图2（D））。

图2

表1显示了受精后96小时观察到的斑马鱼胚胎的典型形态学变化。结果表明，所有药物都会导致斑马鱼幼鱼的异常发育，包括尾部畸形（TM）、卵黄囊水肿（YSE）、心包水肿（PE）和脊柱弯曲（BS）。在这些畸形中，YSE的发生率（0–17.3%）在所有组中最高。

表1

3.1.3自由游泳活动

刚孵出的幼鱼通常是不活动的，或者只是偶尔以缓慢的速度短暂移动（持续几秒钟）。在本研究中，进行了60分钟的光/暗期实验，以探讨ATE、MET、ATO和BZB对幼鱼（受精后120小时）自由游泳活动的影响。如图3所示，与光刺激相比，所有组中的幼鱼在10分钟的黑暗刺激下都更加活跃。在光照期间，暴露于这些药物不会对斑马鱼幼鱼的移动距离产生任何显著影响，但会改变幼鱼对黑暗刺激的反应。熄灯后，ATO、BZB、ATE和MET分别将斑马鱼幼鱼的总移动距离（10分钟）减少了14%–63%、0–43%、0–41%和9%–33%。此外，平均速度分别降低了20%-72%、11%-62%、5%-50%和5%-36%。

图3

3.2.BZB的表观遗传毒性

发育毒性实验结果表明，ATO和BZB的毒性大于ATE和MET。一些疾病与过氧化物对表观遗传调控的调节有关。因此，本研究关注BZB对斑马鱼的潜在表观遗传毒性。

3.2.1.BZB的生物累积

0.5和5μg·L-1 BZB未导致成年斑马鱼死亡，而50和500μg·L-1 BZB实验组的死亡率分别为1.1%和2.2%。图4（A）显示了暴露于0.5、5、50和500μg·L-1 BZB 30天的斑马鱼组织中BZB的浓度。BZB在组织中的累积浓度随着暴露浓度的增加而增加。在相同的暴露浓度下，BZB在肝脏（148–370 ng/g）中的累积浓度明显高于肾脏（113–288 ng/g）、肠道（122–271 ng/g），鳃（110–245 ng/g）和大脑（96–236 ng/g）。作为一种脂质调节剂，BZB主要积聚在肝脏中，因为它是鱼类储存脂质和氧化脂肪酸的主要器官。如图4（B）所示，30天净化后，一些BZB残留在肝脏（38–110 ng/g）、肾脏（28–80 ng/g）和大脑（18–74 ng/g）中，肠道（13–74 ng/g）和鳃（7–61 ng/g）。结果表明，BZB可以在斑马鱼的组织中长期积累。

图4

3.2.2 BZB诱导组织中的全局DNA甲基化

BZB对斑马鱼组织GDM水平的影响如图5所示。BZB的暴露导致斑马鱼大脑、鳃、肠、肝脏和肾脏GDM水平的剂量依赖性降低。低浓度（即0.5和5μg·L-1）的BZB暴露导致斑马鱼大脑GDM水平下降4.3%–6.4%，鳃GDM水平降低6.1%–6.7%，肠道GDM水平减少7.1%–14.6%，肝脏GDM水平升高2.0%–12.5%，肾脏GDM水平降5.1%–10.5%。当暴露浓度分别为0.5和5μg·L-1时，这些组织中的GDM水平没有显著差异（p>0.05）。然而，当暴露浓度分别为50和500μg·L-1时，肝脏（27.7%–38.3%）GDM水平的下降明显大于肾脏（17.4%–31.4%）、肠道（13.7%–29.1%）、大脑（11.4%–26.7%）和鳃（13.9%–22.1%）（p<0.05）。

图5

3.2.3.BZB诱导的肝脏基因表达

如图6所示，肝脏中PPARα、Dnmt1和p53的表达随着暴露浓度的增加而上调。与对照组相比，暴露于50和500μg·L-1的BZB分别将PPARα的表达上调2.3倍和7.6倍，而低暴露浓度（0.5和5μg·L-1）不会造成任何显著影响。与对照组相比，暴露于50和500μg·L-1的BZB分别导致Dnmt1表达增加1.8倍和3.5倍，而低暴露浓度未造成显著影响。此外，暴露于5–500μg·L-1BZB可将p53的表达上调2.9至4.8倍，而0.5μg·L-1 BZC则无明显影响。长期暴露于较高浓度（50–500μg·L-1）的BZB可能会导致斑马鱼有肝癌发生的风险。

图6

4.结论

对于四种药物阿替洛尔（ATE）、美托洛尔（MET）、阿托伐他汀（ATO）和苯扎贝特（BZB）的研究结果表明，这些药物均导致斑鱼胚胎自发运动减少和孵化延迟，阿托伐他汀（ATO）和苯扎贝特（BZB）的抑制作用比阿替洛尔（ATE）和美托洛尔（MET）更强。药物暴露会对斑马鱼幼鱼造成亚致死毒性影响，如孵化率、体长和心率降低，阿托伐他汀（ATO）还导致幼鱼眼睛肿胀5%-15%。在接触药物的幼鱼中观察到卵黄囊水肿、心包水肿、脊柱弯曲和尾部畸形，卵黄囊水肿是最常见的畸形。此外，药物可以抑制自发运动和自由游泳活动。在暴露于0.5μg·L-1至500μg·L-1苯扎贝特（BZB）的成年斑马鱼（4个月大）的肝脏、肾脏、肠道、鳃和大脑中观察到苯扎贝特（BZB）的积累和全局DNA甲基化水平的降低。肝脏是苯扎贝特（BZB）积累和DNA低甲基化发生的主要器官。在肝脏中，还观察到与脂质代谢（PPARα）、DNA甲基化（Dnmt1）和凋亡（p53）相关的基因过度表达。目前的研究结果表明，长期接触低浓度的心血管药物可能会对水生生态系统造成严重威胁。

参考文献

Ping, S., Lin, W., Ming, R., He, Y., Yin, Y., & Ren, Y. (2022). Toxic effects of four cardiovascular drugs on the development and epigenetics of zebrafish (Danio rerio). Science of the Total Environment, 846, 157360.

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